Este primeiro caso de manipulación xenética nun lagarto creou un organismo modelo que podería axudar a comprender mellor a evolución e o desenvolvemento dos réptiles.
CRISPR-Cas9 ou simplemente CRISPR é unha ferramenta de edición de xenes única, rápida e económica que permite a edición dun xenoma eliminando, engadindo ou alterando ADN . O acrónimo CRISPR significa "Repeticións palindrómicas agrupadas regularmente intercaladas". Esta ferramenta é sinxela e máis precisa que os métodos anteriores utilizados para a edición de ADN.
A ferramenta CRISPR-Cas9 inxecta organismos na fase de cigoto (unha soa célula) cunha construción de ADN feita de (a) encima Cas9 que actúa como "tesoiras" e pode cortar ou eliminar unha parte do ADN, (b) ARN guía (unha secuencia que coincide co xene diana e, polo tanto, guía o encima Cas9 á localización diana). Unha vez cortada unha sección diana de ADN, a maquinaria de reparación do ADN da célula volverá unirse á cadea restante e, no proceso, silenciará o xene diana. Ou o xene podería "corrixirse" usando un novo molde de ADN modificado nun proceso chamado reparación dirixida por homoloxía. Así, a ferramenta CRISPR-Cas9 permite modificacións xenéticas inxectando solucións de edición de xenes nun óvulo fertilizado unicelular. Este proceso causa unha alteración xenética (mutación) en todas as células posteriores que se producen, o que afecta á función dos xenes.
Aínda que CRISPR-Cas9 úsase habitualmente en moitas especies, incluíndo peixes, aves e mamíferos, ata agora non tivo éxito na manipulación xenética dos réptiles. Isto débese principalmente a dúas barreiras. En primeiro lugar, as femias de réptiles almacenan esperma durante moito tempo no seu oviducto, polo que é difícil determinar o momento exacto da fecundación. En segundo lugar, a fisioloxía dos ovos dos réptiles ten moitas características como cascas de ovos flexibles, fraxilidade sen espazo de aire no seu interior que fai difícil manipular os embrións sen causar rotura ou dano.
Nun artigo subido a bioRxiv o 31 de marzo de 2019, uns investigadores informaron do desenvolvemento e as probas dun método para empregar a edición xenética CRISPR-Cas9 en réptiles por primeira vez. A especie de réptil escollida no estudo foi un lagarto tropical chamado Anolis sagrei ou, máis comunmente, anole marrón, que está moi estendido no Caribe. Os lagartos do estudo foron recollidos dunha rexión salvaxe de Florida, EUA. Esta especie é ideal para o estudo debido ao seu tamaño miniatura, longa tempada de reprodución e tempo medio relativamente curto entre dúas xeracións.
Para superar as limitacións ás que se enfrontan actualmente os réptiles, os investigadores microinxectaron compoñentes CRISPR en ovos inmaduros non fertilizados mentres os ovos aínda estaban nos ovarios das femias antes da fecundación. Apuntáronse ao xene da tirosinase que produce un encima que controla a pigmentación da pel nos lagartos e se se elimina este xene o lagarto nacería albino. Este claro fenotipo de pigmentación foi o motivo para escoller o xene da tirosinase. Os óvulos microinxectados maduran despois dentro da femia e son posteriormente fecundados naturalmente cun macho introducido ou esperma almacenado.
Como resultado, catro lagartos albinos naceron unhas semanas despois, o que confirma que o xene da tirosinase se desactivara e que o proceso de edición xenética fora exitoso. Dado que a descendencia contiña un xene editado de ambos os proxenitores, estaba claro que os compoñentes de CRISPR permanecían activos moito máis tempo no ovocito inmaduro da nai e, despois da fecundación, mutaban os xenes paternos. Polo tanto, os lagartos albinos mutantes exhibiron tirosinase manipulada nos xenes herdados tanto da nai como do pai, xa que o albinismo é un trazo herdado de ambos os proxenitores.
Este é o primeiro estudo que produce de forma efectiva réptiles modificados xeneticamente. A investigación podería funcionar de forma similar noutras especies de lagartos como as serpes para as que os enfoques actuais non tiveron éxito ata o momento. Este traballo podería axudar a comprender máis a evolución e o desenvolvemento dos réptiles.
***
Fonte (s)
Rasys AM et al. 2019. Preimpresión. Edición do xene CRISPR-Cas9 en lagartos mediante microinxección de ovocitos non fertilizados. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/591446
***
